Pankreas kanseri, yüksek mortalite oranına sahip olduğu için kanserle ilişkili ölümlerde yedinci sıradadır ve 2030 yılına kadar dünyada en ölümcül ikinci kanser türü olacağı tahmin edilmektedir (1). Metastaz oranının yüksek olması nedeniyle progresyonu oldukça agresif olan pankreas kanserinde, klasik olarak uygulanan tedavilerle sağkalım yeterince sağlanamamaktadır. Spesifik semptomlar göstermediği için de pankreas kanserinin en yaygın tipi olan Pankreatik Duktal Adenokarsinoma(PDAK)’nın geç evrelerde ortaya çıkması bu süreçleri zorlaştırmaktadır (2). Pankreas kanseri tedavisini; cerrahi tedaviler, sistemik tedaviler, radyasyon terapileri ve kombine tedaviler olmak üzere temel olarak dört metod oluşturmaktadır. Sistemik tedavileri; kemoterapiler, hedefe yönelik tedaviler ve immünoterapiler oluşturmaktadır. Cerrahi rezeksiyon tedavisi erken evrelerde küratif bir tedavi sunmuş olsa da, cerrahi geçiren hastaların yaklaşık % 80 ninde kanser nüks etmektedir. Ayrıca, PDAK bu klasik tedavi modalitelerine karşı oldukça dirençli

olduğu için yeni tedavi stratejileri araştırılmaya devam etmektedir (3). Bu tedavilerin yüksek başarı sağlayamamasının nedeni terapatik ajanın pankreas kanserinde oluşan yoğun desmoplastik mikroçevreden dolayı hedef ortama ulaşamamasıdır (4). Güncel olarak hem hücrelere ulaşarak terapi direncini azaltan hem de mikroçevreyi regüle edebilecek tedavi arayışları devam etmektedir. Bu perspektifte hücre bazlı tedaviler ümit vericidir ancak olumsuz immünolojik reaksiyon bunların kullanımını zorlaştırmaktadır. Son zamanlarda, özellikle kök hücrelerin hem kendileri hem de salgıladığı keseciklerin terapötik bir rol oynayabileceği düşünülmektedir (5).

 Mezenkimal kök hücreler (MKH), yüksek rejenerasyon potansiyeli olan, immünmodülatör, antiapoptotik, pro-anjiyojenik, kemoatraktant gibi terapötik özelliklere sahip multipotent stromal hücrelerdir (6). MKHler terapötik olarak Graft Versus Host hastalığı, otoimmün hastalıklar, hematolojik maligniteler, kardiyovasküler hastalıklar, nörolojik hastalıklar, organ nakilleri, diyabet ve rejeneratif tıpta allojenik veya otolog olarak kullanılmaktadır (7). MKHler yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda antitümör etkiler gösterse de tümör hücrelerini desteklediğini gösteren çalışmalar da vardır (8). Mezenkimal kök hücreler, kanser terapisinde direkt etkileri MKH kaynağına, dozuna, kanser türüne göre değişiklik gösterdiği için farklı şekillerde modifiye edilerek kanserde terapötik amaçlı olarak çalışılmaktadır (9). TLR4 üzerinden lipopolisakkarit ile indüklenerek oluşan MKH1 karakterinin over, meme ve pankreas kanseri kokültür modellerinde koloni oluşumunu azalttığı gösterilmiştir (46). TLR4 üzerinden oluşturulan proinflamatuvar ADMKHlerin pankreas kanseri hücrelerinde antikanserojenik özellikler gösterirken TLR4 inhibisyonu ile oluşturulan antiinflamatuvar MKHlerin tümörü indükleyici özellikleri gözlemlenmiştir (45). Son zamanlarda MKHlerin hücre dışı veziküllerinin kalp, beyin, böbrek,akciğer ve karaciğer gibi farklı organların akut doku hasarlarında terapötik kullanıldığı, tümör progresyonu üzerindeki etkileri ve kanser tedavisindeki olası potansiyelleri araştırılmaktadır (10). Kanser hücreleri ile MKHler arasındaki etkileşimin kanser hücrelerinde proliferasyon, metastaz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) gibi birçok kritik davranışını düzenlediği ve MKHlerin tümör- tümör mikroçevresini modüle edebilen eksozomlar salgılayabildiğini gösterilmiştir (11). TLR4 üzerinden oluşturulan MKH1 karakterinin direkt ve indirekt pankreas kanseri hücrelerinde tümörü inhibe edici yönde etkileri gözlemlesek de  de bu etkilerin ne kadarının eksozomlar aracılığı ile olduğu belirsizdir (45). Bu çalışmada hem ADMKHlerin kullanılması nedeniyle hem de eş zamanlı hücreler ile kokültüre edilmesinden dolayı  dizayn edilen projeden farklıdır. Bu yayınımızda hem hücrelerin eş zamanlı olarak kokültürde etkilerinin değişmesi hem de tüm sekretom ile etkisi değerlendirilirken eksozoma dair bir araştırma yapılmamıştır. 

Lipid membrandan oluşan bir yapı olan hücre dışı veziküller (EV) hücreler arası uzak iletişimde, lipitler, proteinler, reseptörler ve efektör moleküller gibi farklı türdeki hücresel kargoları alıcı hücrelere taşımak için kargo görevi görür. Apoptotik veziküller, mikroveziküller ve eksozomlar olmak üzere hücre içi kökenlerine göre farklılaşmış üç tip EV bulunmaktadır. Eksozomlar, boyutları 40-100 nm arasında değişen EV olarak tanımlanır ve tüm hücre çeşitleri tarafından salgılanırlar (12). Eksozomların yüzey membranında CD63, CD81, CD82, CD53 ve CD37 proteinleri bulunmaktadır. Çeşitli kaynaklardan üretilen eksozomlar, fonksiyonel mRNAlar, miRNAlar, DNA parçaları, lipidler ve proteinler gibi birçok biyolojik bileşeni hedef hücrelere taşıyabilir (13). İnsan umblikal ven endotel hücreler, MKHler, T hücreleri, B hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler, doğal öldürücü hücreler gibi neredeyse tüm hücre türleri eksozom üretebilmektedir (14,15). Teslim edilen kargo, hedef hücrelerdeki bazı spesifik genleri ve proteinleri düzenleyerek sonunda bunların özelliklerini değiştirebilmektedir (16). Bu özellikleri ile eksozomlar; ilaçların taşınması, tümör süpresör ajanların iletilmesi, immünomodülatör, antiinflamatuvar etki ve nörorejeneratif özellikleri

amaçlarıyla kullanılmaktadır. Mezenkimal hücrelerden üretilen eksozomların, farelere tekrar tekrar enjekte edildiğinde toksisiteye neden olmadığı bildirilmiştir (17). Bununla birlikte eksozomlar, hedefleme, düşük immünojenite, modifikasyon esnekliği ve yüksek beyin bariyeri geçirgenliği gibi kanser tedavisi için ilginç özelliklere sahiptir (18). MKH eksozomlarının tümör hücrelerinin büyümesini, metastazını, apoptozise gidişini, anjiyogenez durumunu, kemosensivitesini ve ilaç direncini etkilediği gösterilmiştir (19). Kemik iliği kökenli MKHlerden elde edilen eksozomlar içerdikleri miR-9 ile Glioblastoma Multiforme hücrelerinde temozolomid ilacına karşı kemosensivitesini arttırmıştır (19). Benzer olarak insan göbek kordonundan elde edilen MKHler, mesane tümörü hücrelerinde proliferasyonu azaltarak apoptozisi indüklemiştir (21). Adipoz doku kökenli MKHlerin in vitro hem in vivo olarak prostat kanserinde BCL-xl aktivitesini azaltarak kaspaz bağımlı apoptozisi indüklediği gösterilmiştir (22). MKHlerin , ilacı alıp daha sonra salma kapasiteleri sayesinde Paclitaxel ile muamele edildikten sonra pankreas kanseri üzerinde güçlü anti-tümör etkisi olduğu gösterilmiştir (23). Adipoz kökenli MKHler tarafından salgılanan eksozomlar Platelet

kökenli büyüme faktörü üzerinden endotel hücrelerinde anjiyogenezi uyardığı gösterilmiştir (24). Tümör hücrelerini inhibe edici özellikler gösterse de literatürde farklı kanser türlerinde in vitro ve in vivo modellerde farklı MKHlerden elde edilen eksozomların tümörü ilerletici etkileri de gösterilmiştir (25). Bir meta-analiz, çalışmaların sırasıyla sadece %26 ve %46;sının kemik iliği kökenli MKHler ve adipoz doku kökenli MKHler için onkosupresif bir etki bildirdiğini, buna karşın %88; inin Wharton jölesi MKHler için tümör baskılayıcı bir rolü doğruladığını göstermiştir (26). Farklı hücrelerden farklı içeriğe sahip eksozomların elde edildiği görülmektedir. Literatürde daha çok Wharton jölesi antitümör etki gösterdiği için ve allojenik olarak kullanılabildiği için planlanacak çalışmalar için umut vaat etmektedir.

Eksozomlar içerisinde; membran proteinleri, sitozolik ve nükleer proteinler, hücre dışı matriks

proteinleri, sitokinler, metabolitler ve mRNA, kodlamayan RNA türleri (miRNA, LncRNA) ve DNA gibi nükleik asitler bulunabilir. Bulunan her içeriğinde kanser hücreleri üzerindeki etkisi vardır ve değişkendir (27). Göbek kordonundan elde edilen MKH eksozomlarının, mide kanseri hücrelerinin ex vivo olarak EMT sürecini indükleyerek ve Akt proteinin uyararak proliferasyonunu, invazyonunu ve metastatik potansiyelini arttırdığı gösterilmiştir (28). Kemik iliğinden elde edilen MKHlerin eksozomları, ERK1/2 sinyalini ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ekspresyonunu arttırarak gastik kanser modelinde tümör anjiyogenezini ve hücre proliferasyonunu uyardığı gösterilmiştir (29). MKHler tarafından salgılanan eksozomların, ekto-5′ nükleotidaz ve MMP-2 aktivitesini başlatarak tümör hücrelerinin fonksiyonel kapasitesini değiştirebileceğini ve sonuç olarak yüksek tümör heterojenliğine ve transforme tümör mikro ortamına katkıda bulunabileceği ileri sürülmüştür (30). Hipoksik kemik iliğinden türetilen MKH eksozomları içerdikleri miR-193-3a, miR-5100, miR-210-3p gibi miRNAlar iler akciğer kanseri hücrelerinde STAT3 aracılı EMT aktivasyonu yoluyl metastazı arttırmıştır (31). Kemik iliği MKH eksozomlarında miR-15a’nın azaldığı

ve bu eksozomlarının multiple myelom hücrelerinde klonal ekspansiyonu desteklediği görüldü (32). Naif MKHlerden üretilen eksozomların değişen içeriklerine göre farklı mekanizmalar üzerinden kanser hücreleri üzerinde ilerletici etkileri de gözlemlenmektedir. Fakat eksozomların MKHler manipüle edildiği veya hedef ajanı taşıyıcı olarak kullanımıyla antitümör etkiler için daha uyumlu görünmektedir. MKHlerden elde edilen eksozomların antikanser etkilerini değerlendirecek olursak; Wharton jölesi MKHlerden salgılanan eksozomlar, U87 glioblastoma multiforme hücrelerinde migrasyonu

azaltır ve eksozomların anti-tümorijenik miRNA’ları taşıdığını ortaya çıkarmıştır (33). Kamerkar ve ark. ise ekstra olarak onkojenik KRAS siRNA’lı eksozomlar ile fare modellerinde pankreas tümöründe hayatta kalma oranını yüksek derecede arttırdıklarını göstermişlerdir (34). Hepatosit büyüme faktörü siRNA içeren eksozomların tümör büyümesi ve anjiyogenezi azalttığı gösterilmiştir. Böylece tümör hedeflemede nanopartiküllerle kıyaslanabilir derecede bir hedef oldukları gösterilmiştir (35). Yan ve ark. kemik iliği kaynaklI MKHlerin eksozomal mir-16-5p;nin kolorektal kanserde integrin α2;yi düzenleyerek apoptozisi indükleyerek tümör büyümesini azalttığı gösterilmiştir (36). İnsan göbek kordonu MKHlerinden türetilen miR-145-5p içeren eksozomlar, in vivo pankreas duktal adenokarsinom modelinde proliferasyonu baskılayarak apoptozisi indüklemiştir (37). Yüksek düzeyde miR-1231 içeren kemik iliğinden elde edilen MKH eksozomları, in vivo ve in vitro pankreas kanserinde invazyon ve metastazı baskılamıştır (38). Kronik myeloid lösemi hücrelerinde kordon kaynaklı MKH eksozomlarının, imatinib ile birlikte

sinerjik etki ile canlılığının inhibisyonunu ve apoptozu desteklediği gösterilmiştir (39). Literatür değerlendirldiğinde MKHlerin değişen mekanizmalar üzerinden antitümör etkiler de gösterdiği görülmektedir. Bu projede MKHleri TLR4 üzerinden polarize ederek proapoptotik ve antitümör ajanların salınımını arttırmayı planlamaktayız. Elde edilen eksozomların içeriği TNF-alfa, IL-6  ve IL-8 miktarı belirlenecektir. Böylece değişen eksozom içeriği sonucunda tümör üzerinde çeşitli mekanizmalar üzerinden antitümör sonuçlar hem  görmeyi hem de arttırmayı hedeflemekteyiz.

Eksozomlar; doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini uyarmak için antijen taşıyıcıları

olarak da hareket edebilirler ve immünmodülatör olarak görev yaparlar (40). MKHler tarafından salgılanan IDO-1 içeren eksozomlar, dendritik hücrelerde ve NK hücrelerinde IFN-y ekspresyonunu azaltarak bağışıklık yanıtını sınırlandırmışlardır (41). Ayrıca MKHlerden türetilen eksozomların IL-10salgılanmasını indükleyerek ve düzenleyici T hücrelerinin sayısını artırarak bağışıklık yanıtlarını azaltabildiği gösterilmiştir ( 42). Adipoz kökenli MKH kökenli miR-10a yüklü eksozomların, Th17 ve Treg yanıtını uyarırken Th1 yanıtını azalttığını göstermektedir. Böylece anti-tümör eksozom kullanımı immünoterapötik stratejiler doğrultusunda yeni terapötik potansiyeller için umut vaad etmektedir (43). Bu projede antikanser etkiler gözlemledikten sonra bu eksozomların immünmodülatör etkisini THP-1 hücreleri üzerindeki etkiler üzerinden değerlendirmek istemekteyiz.Tümör mikroçevresi tümörün ilk aşamalarında proinflamatuvar fenotipteyken zamanla aldığı sinyaller doğrultusunda antiinflamatuvar karaktere dönüşmektedir. Eğer bu proinflamatuvar fenotip sürdürülebilirse hem immün sistem aktif kalacak hem de tümör hücreleri üzerine inhibitör etkileri devam edecektir (44). Eksozomlarla modüle edilen sitokin/kemokin salınımının bu ani artışı, anti- tümör immün yanıtlarının uyarılmasına veya immün baskılayıcı bir etkiye neden olabilir. Bu nedenle, eksozomlar tedavi edilmediğinde hem bir nimet hem de bir felaket olabilir. Bu yüzden hedefe yönelik planlanan eksozomların uygulanması daha faydalı olacaktır (30).  Bu çalışmalar göz önüne alındığında TLR4 reseptörü uyarılmış MKHlerden üretilen eksozomların pankreas kanseri hücreleri üzerindeki etkileri konusunda bir netlik yoktur ve moleküler düzeyde herhangi bir çalışma yapılmamıştır.  Aynı zamanda  TLR4 reseptörü uyarılmış MKHlerden üretilen eksozomların immün hücre modeli olan  THP-1 monositlerinde de etkisi bilinmemektedir.  MKHlerin eksozomlarının tümör mikroçevresindeki rolünün anlaşılması ve manipüle edebiliyor olmamız daha sonra geliştirilecek olan terapötik yaklaşımlar için yol gösterici olacaktır. Bununla birlikte, MKHlerden türetilen eksozomların terapötik etkinliğine ilişkin artan kanıtlara rağmen, kliniğe geçişi için kanser hücreleri üzerindeki etkilerinin daha derinlemesine araştırılmasına ihtiyaç vardır.